DNA-Sonden, Hybridisierung, Microarrays und Klonierung

DNA-Sonden-Hybridisierung

Gen-spezifische Suche

DNA-Hybridisierung ist ein natürliches Phänomen, das eine der grundlegenden Techniken in der rekombinanten DNA-Technologie darstellt.

Die Hybridisierung der AON ist der Prozess, in dem zwei Einzelstränge von DNA mit

einer komplementären Basensequenz sich verbinden und zu einer DNA-Doppelhelix führen.

Doppelstränge korrekt gepaart.

Aber warum ist die DNA-Hybridisierung eine grundlegende Technik für die Biotechnologie? Weil sie das Vorhandensein eines Gens, das für ein Protein von Interesse kodiert, auf einem Chromosom identifizieren kann. Zudem.

Was also geschieht, ist ein Hybridisierungsassay mit einer DNA-Sonde.

Eine Sonde ist ein Fragment der AON, eine künstliche Einzelstrang-DNA, das radioaktiv markiert oder mit Fluoreszenz markiert ist und dessen Nukleotidsequenz komplementär zur Sequenz des Gens ist, das nachgewiesen werden soll.

Der Nachweis, dass eine DNA-Sonde hybridisiert hat, erfolgt durch eine Vielzahl von Methoden,

beispielsweise durch Belichtung von Röntgenfilm.

Wenn man gleichzeitig Tausende von Genen mittels Microarrays oder Chips analysieren möchte,

hat die AON-Microarray-Technologie die Genetik in ähnlicher Weise revolutioniert wie Siliziumchips die Computerindustrie.

Revolutionen der Computer-Industrie.

Die Biochips sind Glasträger, auf denen sich in jeder mikroskopischen Zelle

eine kleine Anzahl von Fragmenten einzelsträngiger DNA befinden, deren Nukleotidsequenz als Sonde für ein bestimmtes Gen dient.

Tausende von mikroskopisch kleinen Zellen sind in einem Raster auf dem Objektträger aus Glas (deren Größe nicht größer als eine Briefmarke ist) angeordnet und ermöglichen die parallele Durchführung von Tausenden von

Hybridisierungsreaktionen. Da die genaue Lage der einzelnen Sonde auf dem Biochip bekannt ist,

kann jedes DNA-Fragment, das mit einer von ihnen hybridisiert, als ein bestimmtes Gen identifiziert werden, indem einfach die Position der Sonde auf dem Biochip betrachtet wird.

Microarray-Anwendungen

Die Microarray-Technologie wird verwendet, um:

• Erkennen von Mutationen in Genen, die Krankheiten wie Hämophilie, zystische Fibrose, Huntington-Krankheit oder Duchenne-Muskeldystrophie verursachen.
• Steuerung der Expression von Genen in menschlichen Zelllinien.
• Diagnose von Krankheiten.
• Anpassen der Behandlung mit Medikamenten, da genetische Unterschiede unterschiedliche individuelle Reaktionen auf die Behandlung erzeugen.
• Vorschlagen neuer diagnostischer Verfahren und Therapien.

DNA-Klonierung

Das Wort "Klonen" bedeutet die Herstellung genetisch identischer Kopien durch asexuelle Reproduktion. Die daraus resultierende Population wird als Klon bezeichnet. Aber was bedeutet das Wort, wenn es auf DNA angewendet wird?

Klonierung eines Fragments von AON bedeutet, Milliarden von identischen Kopien dieses Fragments zu erhalten.

Um ein DNA-Fragment zu klonen, muss es an ein Trägermolekül angefügt werden, auch Vektor genannt.

Ein Klonierungsvektor ist ein kleines DNA-Molekül, das in der Lage ist, in ein Bakterium einzudringen und in ihm repliziert zu werden.

Derzeit gibt es viele Klonierungsvektoren, obwohl am häufigsten bakterielle Plasmide verwendet werden. Die Klonierungsmethode ist wie folgt:

Die Plasmid-DNA und die zu klonende DNA werden mit demselben Restriktionsenzym geschnitten. Durch das Schneiden werden Plasmidfragmente geöffnet und rekombinante Plasmide erhalten.

Diese rekombinanten Plasmide werden mit einer Bakterienkultur (in der Regel Escherichia coli) unter geeigneten Bedingungen inkubiert, sodass jede Zelle nur ein rekombinantes Plasmid enthält. Dieser Vorgang wird Transformation genannt.

Da die Plasmide ein Gen tragen, das Resistenz gegen ein Antibiotikum vermittelt, können transformierte Bakterien durch Auswahl auf Kulturplatten mit diesem Antibiotikum isoliert werden.

Nur Bakterien, die das rekombinante Plasmid tragen, überleben und bilden Kolonien auf den Platten. Andere, die nicht transformiert wurden und somit das rekombinante Plasmid nicht tragen, sterben.

Jede Kolonie von transformierten Bakterien wird isoliert und unter Wachstumsbedingungen gehalten. Da sich die Bakterien vermehren, verdoppelt sich auch die Anzahl der rekombinanten Plasmide und der eingefügten DNA-Fragmente.

Die Sammlung von AON-Klonen aus einer DNA-Bibliothek von Interesse wird als AON-Bibliothek oder DNA-Bibliothek bezeichnet.

Aus winzigen Mengen kann die AON vervielfältigt oder viele Male innerhalb eines Reaktionsröhrchens verstärkt werden, ohne Klonierung.

Die Technik basiert auf einem Prozess namens Polymerase-Kettenreaktion (PCR).

PCR ist eine Methode, die Millionen bis Milliarden von Kopien eines bestimmten Segments der DNA erzeugt, durch wiederholte Zyklen von Replikation der DNA in vitro.

Als Ausgangsmaterial werden einige Moleküle der Ziel-DNA benötigt, die nicht unbedingt hochgradig gereinigt sein müssen; außerdem werden die vier Desoxynukleotid-Triphosphate, zwei kurze einzelsträngige DNA-Moleküle (Primer), die komplementär zu den Sequenzen sind, die das zu kopierende Gen flankieren, und eine hitzestabile DNA-Polymerase wie Taq (aus Thermus aquaticus, in der Nähe der Geysire von Yellowstone entdeckt) benötigt, um neue DNA-Stränge zu synthetisieren.

PCR ist ein routinemäßiges Werkzeug, um Segmente der DNA aus einer Vielzahl von Quellen zu verstärken, zum Beispiel DNA aus kleinen Mengen von Gewebe, Blut oder Sperma am Tatort eines Verbrechens, DNA pathogener Mikroorganismen zur Identifizierung oder DNA von embryonalen Zellen für eine pränatale Diagnose genetischer Krankheiten.