Homogenisierung von Gewebe und Proteinbestimmung
Gewebehomogenisierung und Proteinreinigung
Gewebe sind reich an Proteinen, die verschiedene Funktionen erfüllen und daher unterschiedliche Eigenschaften besitzen. Je nach diesen Eigenschaften ist es möglich, sie durch verschiedene Methoden zu solubilisieren, zu trennen und zu reinigen.
Zellaufschluss und Homogenisierung
Der erste Schritt bei der Gewinnung der meisten Proteine und subzellulären Strukturen ist der Aufschluss von Geweben oder Zellen in ein Zelllysat. In diesem liegen das Protein, der Multiproteinkomplex oder die subzelluläre Struktur unter Bedingungen vor, die eine Isolation ermöglichen. Dies erfolgt unter Verwendung von Verfahren, die gemeinhin als weiche mechanische Homogenisierung bekannt sind. Diese Methoden führen zum vorsichtigen Aufbrechen der Zellmembranen und geben so den Zellinhalt frei. Zu diesen Methoden gehören:
- Osmotischer Schock
- Mörsern (Reibung)
- Sonikation
Die gewonnenen Proteine müssen in einem Puffer solubilisiert werden, der hilft, sie aus den Zellen zu extrahieren und für die spätere Verwendung zu stabilisieren.
Das Ziel dieses Praktikums ist die Durchführung eines Protokolls zur Gewebehomogenisierung und zur Gewinnung von Gesamtprotein für die weitere Quantifizierung und Charakterisierung.
Bestimmung der Proteinkonzentration
Eine der am häufigsten in Forschungslaboren verwendeten Operationen ist die Bestimmung der Gesamtkonzentration von Proteinen in einer Probe. Die Bradford-Methode wird häufig zur schnellen und genauen Bestimmung von Gesamtproteinen aus Zellfraktionen sowie der Proteinkonzentration für den Einsatz in der Gelelektrophorese verwendet.
Der Bradford-Test und seine Funktionsweise
Der Standardtest hat eine Empfindlichkeit von 0,1 bis 1,4 mg/ml Protein. Der Test basiert auf der Beobachtung der Veränderung der maximalen Absorption einer sauren Lösung von Coomassie-Brillant-Blau, die sich bei der Bindung an das Protein von 465 nm auf 595 nm verschiebt. Diese Bindung erfolgt durch die Stabilisierung der anionischen Form des Farbstoffs mittels hydrophober und ionischer Wechselwirkungen, was zu einem sichtbaren Farbumschlag führt.
Der Farbstoff besitzt eine große Anzahl unpolarer Gruppen sowie zwei polare Gruppen (SO32-), die an positive Ladungen der Aminosäure-Seitenketten wie Arginin oder Lysin binden, was einen spezifischen Nachteil der Methode darstellt.
Eichkurve und Standardproteine
Dieser Test erfordert zudem die Erstellung einer Eichkurve zur Bestimmung der Proteinkonzentration in einer Probe, wobei häufig BSA (Rinderserumalbumin) als Standardprotein verwendet wird.