Grundlagen der rekombinanten DNA-Technologie und Gentechnik
Grundlagen der rekombinanten DNA-Technologie
Die rekombinante DNA-Technologie nutzt Werkzeuge wie Restriktionsenzyme und Organismen wie Saccharomyces cerevisiae, um kodierende und regulatorische Sequenzen zu manipulieren.
Restriktionsendonukleasen und Gelelektrophorese
Restriktionsendonukleasen sind bakterielle Enzyme, die in der Lage sind, die DNA an spezifischen, meist palindromischen Erkennungssequenzen zu schneiden. Dabei entstehen entweder stumpfe Enden (blunt ends) oder kohäsive Enden (sticky ends). Die Trennung der DNA-Fragmente erfolgt mittels Gelelektrophorese in Agarose- oder Polyacrylamidgelen.
Vektoren und DNA-Ligasen
Als Vektoren dienen bakterielle Plasmide, virale Genome oder künstlich synthetisierte DNA-Moleküle. DNA-Ligasen verknüpfen diese Fragmente durch kovalente Bindungen. Komplementäre DNA (cDNA) wird aus einer RNA-Vorlage synthetisiert, da Boten-RNA (mRNA) keine Introns oder repetitiven regulatorischen Regionen enthält.
De-novo-Synthese und Hybridisierung
Die De-novo-Synthese von DNA-Oligonukleotiden erfolgt oft an Kieselgel-Trägern, gefolgt von Zentrifugation und Filtration. Die Hybridisierung basiert auf der Paarungsfähigkeit einzelsträngiger Nukleinsäuren (Sonden) zur Identifizierung von Genen mittels komplementärer Paarung. Man unterscheidet zwei Haupttypen:
- Southern Blot: DNA-DNA-Hybridisierung
- Northern Blot: DNA-RNA-Hybridisierung
Genbibliotheken und PCR-Verfahren
Genomische Bibliotheken werden in Bakterien zur Lagerung eingeführt, was Zeit spart. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ermöglicht die exponentielle Vervielfältigung eines DNA-Fragments. Hierfür werden eine DNA-Polymerase (aus thermophilen Bakterien), geeignete Primer, eine DNA-Vorlage und Desoxynukleotid-Triphosphate benötigt. Der Prozess nutzt die Denaturierung bei hohen Temperaturen und wird in der Medizin, Kriminologie, Archäologie und Paläontologie angewendet.
Schritte der Genklonierung
- Isolierung und Gewinnung des Gens.
- Auswahl des Klonierungsvektors.
- Bildung rekombinanter DNA.
- Einführung in die Wirtszelle (Hospedator).
- Überprüfung der Genexpression.
Vektortypen für Bakterien
Die Wahl des Vektors hängt von der Größe des Gens ab:
- Plasmide: Kleine, zirkuläre DNA-Moleküle mit eigenem Replikationsursprung und Selektionsmarkern (z. B. Antibiotikaresistenz).
- Phagen-Vektoren: Nutzen Genome von Viren (z. B. Lambda- oder M13-Phagen).
- Künstliche Chromosomen: Werden für sehr große DNA-Fragmente verwendet.
Wirtszellen und DNA-Transfer
Wirtszellen müssen schnell wachsen, nicht pathogen sein und in der Lage sein, DNA aus der Umgebung aufzunehmen oder stabil zu replizieren. Die Transduktion beschreibt das Einbringen von DNA über virale Genome (z. B. lysogene Phagen), wobei der lytische Zyklus unterdrückt wird. Das Screening erfolgt über phänotypische Marker wie Antibiotikaresistenzen oder radioaktive Sonden.
Klonierung in eukaryotischen Zellen
Eukaryotische Gene enthalten Introns, was die Komplexität der Expression erhöht. Transgene Organismen entstehen durch das Einfügen von Genen in Embryonalzellen, während die Gentherapie auf somatische Zellen abzielt.
Spezielle Vektoren für Eukaryoten
Für Eukaryoten werden Retroviren (Integration ins Chromosom), Adenoviren (temporäre Expression) oder künstliche Hefechromosomen (YACs) verwendet. YACs enthalten Zentromere, Telomere und spezifische Replikationsursprünge für sehr große DNA-Mengen. Das Ti-Plasmid aus Agrobacterium tumefaciens wird genutzt, um DNA in Pflanzenzellen zu übertragen, wobei die Virulenzgene entfernt werden.
Methoden des Gentransfers
- Mikroinjektion: Direkte Injektion mittels einer Glaskapillare mit sehr kleinem Durchmesser durch die Zellmembran.
- Elektroporation: Kurze elektrische Impulse machen die Membran für die DNA durchlässig.
- Gen-Kanone (Biolistik): Beschuss mit Partikeln, die mit genetischem Material beschichtet sind.
- Liposomen: DNA-Einschluss in Lipiddoppelschicht-Bläschen, die mit der Zellmembran verschmelzen.
Ziele der Gentechnik
Die Hauptziele der Gentechnik umfassen das Einführen neuer Gene in ein Genom, das Löschen (Knock-out) bestimmter Gene, die Modifikation genetischer Informationen, die Änderung von Genexpressionsmustern sowie das Klonen von Lebewesen und Organen.