Proteine: Aufbau, Struktur, Funktionen und Elektrophorese

Proteine: Einführung

Gebildet durch Aminosäuren (AA).

Aminosäuren: Grundlagen

Mit einer Aminogruppe: Basisch.

Mit einer Carboxylgruppe: Sauer.

Wesentliche Aminosäuren werden vom Körper synthetisiert.

Aminosäuren unterscheiden sich untereinander in der Struktur der Seitenketten; diese Seitenketten sind die R-Gruppen.

Amphoterer Charakter: Sie verhalten sich gegenüber geladenen oder ungeladenen Teilchen je nach pH-Wert des Mediums.

Ladungszustand in Abhängigkeit vom pH-Wert

Zwitterionen: Ionen mit Dipolcharakter und insgesamt netter Ladung null.

Isoelektrischer Punkt (pI)

pI (isoelektrischer Punkt): pH-Wert, bei dem eine Aminosäure oder ein Protein eine Nettoladung von null hat.

AA ? 2 oder mehr Einheiten pro PI: negative Nettoladung

? AA 2 oder mehr Einheiten pro PI: positive Nettoladung

Struktur der Proteine

Primary

Primärstruktur: Reihenfolge (Sequenz) der Aminosäuren eines Proteins.

Die Abfolge entspricht der genetischen Information von DNA zur mRNA (Transkription und Translation).

Secondary

Sekundärstruktur: regelmäßige und periodische Anordnungen entlang einer Richtung.

Drei Konformationen:

• α-Helix
• Beta-Faltblatt
• Random Coil (ungeordnete Schleife)

Tertiär

Tertiärstruktur: Biegen oder Falten der Sekundärstrukturelemente auf sich selbst.

Ist einzigartig für jedes Protein und bestimmt die biologischen Eigenschaften.

Quartär

Quartärstruktur: Bindung mehrerer Polypeptidketten (Untereinheiten) zu einem funktionellen Komplex.

Protein-Klassifikation

Einfache Proteine

Enthalten nur Aminosäuren.

Kugelförmig

Polypeptidketten gefaltet zu sphärischen Formen.

• Albumin
• Globulin
• Histone

Faserförmig

Polypeptidketten parallel angeordnet (lange Fasern oder Fäden).

• Collagen
• Keratine
• Elastin

Beispiele

• Myosin (Muskel)
• Fibrinogen

Konjugierte Proteine

Proteine mit nicht-proteinogenen Komponenten (prosthetische Gruppen).

Apoprotein: Proteinanteil ohne die Nicht-Protein-Komponente.

Typen konjugierter Proteine

Protein-Funktionen

Serum- und Plasma-Proteine

Serum-Proteine: 6,2–8,5 g/dl (Referenzbereich).

Plasma

Plasma besteht zu ~90% aus Wasser und enthält Fibrinogen (im Gegensatz zu Serum, in dem Fibrinogen fehlt).

Serum-Protein

Werden in der Leber synthetisiert.

Ig (Immunglobuline) werden nicht in Hb (Hämoglobin) gefunden.

Bestimmungsmethoden für Proteine

Kjeldahl

Erfasst den Gesamtstickstoffgehalt einer Probe.

Dabei werden organische Stickstoffverbindungen in ammoniakalische Verbindungen (NH4 / NH3) umgewandelt.

Nicht überall verwendet.

Biuret

Bestimmt das Gesamtserumprotein.

Peptidbindungen von Proteinen reagieren im alkalischen Medium mit Kupferionen (Cu2+).

Es entsteht ein violetter Komplex, der spektrophotometrisch bei 540 nm gemessen wird.

Referenzmethode; Verfahren häufig automatisiert.

Lowry

Die Probe wird mit einer alkalischen Kupferlösung behandelt.

Dann wird das Folin-Ciocalteau-Reagenz (Phenolreagenz) hinzugefügt.

Die reduzierte Reaktion führt zur Bildung einer blauen Färbung (Phosphorwolframsäure und Phosphormolybdänsäure werden reduziert).

UV-Absorption

Proteine absorbieren Licht bei 210 nm.

Manuelle oder automatische Messung möglich.

Refraktometrie

Misst den Brechungsindex einer Lösung.

Licht erfährt eine Richtungsänderung beim Durchgang durch eine Lösung; diese Änderung hängt von der Menge der gelösten Stoffe ab.

Manuelle Methode.

Protein-Elektrophorese

Definition

Basierend auf der Bewegung geladener Teilchen in einem elektrischen Feld.

Typen der Elektrophorese

In Flüssigmedium (freie oder mobile Phase) oder in inerten Medien (z. B. Gele), die eine bessere Auflösung der Banden bieten.

Puffer und pH

Proteine sind amphotere Moleküle (positiv oder negativ, abhängig vom pH-Wert).

Man wählt Puffer in Abhängigkeit vom isoelektrischen Punkt (pI) der Proteine.

Bei Verwendung eines Puffers bei pH 8,6 sind die meisten Proteine negativ geladen und wandern zur Anode (positiver Pol).

Pufferfunktion: Den pH-Wert konstant halten, damit die Ladung jedes Proteins während der elektrophoretischen Trennung stabil bleibt.

Eine höhere Ionenstärke des Puffers verlangsamt die Migration (Banden werden schärfer, aber dichter beieinander).

Häufig verwendeter Puffer: Barbitalpuffer bei pH 8,6 (oft genutzt).

Alternativ: Barbital mit Lactat und Ca2+ bei pH 8,6.

Bei veränderter Temperatur treten breitere Banden auf.

Medientypen

Schritte der Elektrophorese

1. Elektrophoretische Trennung durch Anlegen eines elektrischen Feldes.
2. Fixierung und Trennung der Proteinfraktionen.
3. Nachweis der Proteinfraktionen durch Färbung (z. B. Amidoschwarz oder Ponceau S).
4. Entfärbung: Methanol-Essigsäure oder Essigsäure-Wasser-Lösung.
5. Quantifizierung der elektrophoretischen Fraktionen.

Quantifizierung der Fraktionen

Elution

Fraktionen werden ausgeschnitten und mit Lösungsmitteln eluiert; die Absorption wird gemessen, um den Anteil jeder Fraktion zu berechnen.

Densitometrie

Mit speziellen Photometern wird die Färbung jeder Fraktion quantifiziert.

Das Ergebnis wird in einem Graphen dargestellt und als Spektrum oder elektrophoretisches Muster visualisiert.

Elektrophoretische Fraktionen und deren Bedeutung

α1-Globuline

α2-Globuline

β-Globuline

Gamma-Globuline

?: Lebererkrankung / chronische Infektion / multiplen Myelom

?: Senior / CLL / Agammaglobulinämie

Albumin

Fibrinogen erscheint in den Bruchteilen ß und γ, wenn die Probe Plasma ist (bei Serum fehlt Fibrinogen).

Änderungen der elektrophoretischen Muster

Lebererkrankung

Albumin ?

? ?-Globulin

Gamma-Globulin ?

Entzündliche Erkrankungen

Nephrotisches Syndrom

↓ Albumin

= ? oder Gamma-Globulin

↑ α2-Globulin

Monoklonale Gammopathie

↑ Gamma-Globuline (monoklonale Spitze)

Bsp.: Multiples Myelom

Waldenström-Makroglobulinämie: klonale B-Zell-Proliferation mit monoklonaler IgM-Komponente

Leberzirrhose

O = ? ?

↑ Gamma-Globulin

Plasma-Lipoproteine

Sind in Wasser unlöslich.

Amphipathische Moleküle (mit polaren und apolaren Gruppen).

Sind kolloidale Lösungen (in Plasma dispergiert).