Aufreinigung von Plasmid-DNA: Methoden und Techniken

LAB # 4: Aufreinigung von Plasmid-DNA.
Einführung
Plasmide sind ringförmige DNA-Moleküle, die genetisches Material darstellen und unabhängig vom Chromosom der Wirtszelle replizieren. Sie kommen natürlich in Bakterien in Größen von ca. 5.000 bis 400.000 Basenpaaren vor.
Die darin enthaltenen Informationen können auf die Wirtszelle übertragen werden, wie z. B. Antibiotikaresistenz und die Fähigkeit zum Abbau von aromatischen Verbindungen zur Vergärung von Zucker, unter anderem. Die Anzahl der Plasmide in einer Zelle kann variieren; einige Bakterien enthalten keine Plasmide, während andere mehrere Kopien besitzen. Wenn ein Plasmid die Fähigkeit hat, sich in das bakterielle Chromosom einzufügen, wird es als Episom bezeichnet.
Viele Methoden wurden entwickelt, um Plasmid-DNA aus Bakterien zu reinigen. Alle diese Reinigungsmethoden erfordern immer folgende Schritte:

1. Das Wachstum der Bakterienkultur.
2. Das Sammeln und die bakterielle Lyse.
3. Die Plasmid-DNA-Aufreinigung.

Das Wachstum von Bakterienkulturen.
Es ist möglich, Plasmide aus einer Bakterienkultur zu reinigen, indem man eine einzige transformierte Kolonie von einer Agarplatte entnimmt. Gewöhnlich wird die Kolonie in ein kleines Volumen Flüssigkeitskultur übertragen, die in der letzten Phase der logarithmischen Wachstumsphase angebaut wird. Diese Ernte kann verwendet werden, um kleine Mengen von Plasmid-DNA (Minipräparation) vorzubereiten oder in größerem Maßstab, um Kulturen für größere Mengen an Plasmid-DNA (MIDI- und Maxipräparationen) vorzubereiten. Während dieser gesamten Zeit können die transformierten Bakterien selektiv mit geeigneten Antibiotika gewachsen werden.
Sammlung und Lyse von Bakterien.
Die Bakterien werden durch Zentrifugation aus einer Bakterienkultur geerntet und dann durch eine oder mehrere Methoden, einschließlich ionischer und nichtionischer Detergentien, organischer Lösungsmittel, Laugen und Hitze, lysiert. Die Wahl der Methode zur Analyse von Plasmid-DNA hängt von drei Faktoren ab: der Größe, dem Stamm von E. coli und der Technik, die später zur Reinigung verwendet wird.
Plasmid-DNA-Aufreinigung.
Die angewandten Methoden ermöglichen es, Plasmid-DNA zu erhalten, die jedoch immer mit großen Mengen von RNA und chromosomaler DNA E. coli kontaminiert ist. Diese Verunreinigungen müssen entfernt oder auf ein Minimum reduziert werden, um Plasmid-DNA von guter Qualität zu erhalten, die beispielsweise für die Transfektion in Säugetierzellen verwendet werden kann. Sobald die Plasmid-DNA isoliert ist, kann sie in Agarosegelen visualisiert werden und als Substrat für viele Restriktionsenzyme und DNA-Polymerasen verwendet werden.
Die alkalische Lyse-Methode in Kombination mit dem Detergens SDS wird seit über 20 Jahren verwendet, um Plasmid-DNA aus E. coli zu isolieren (Birnboim und Doly, 1979). Die Exposition der Bakterien gegenüber einem ionischen Detergens und einem hohen pH-Wert öffnet die Zellwand, denaturiert chromosomale DNA und ermöglicht die Freisetzung von Plasmid-DNA in den Überstand. Obwohl die alkalische Lösung die gepaarten Basen aufbricht, sind die DNA-Stränge des ringförmigen Plasmids nicht voneinander getrennt und bleiben topologisch verbunden. Eine längere Exposition gegenüber OH kann schädlich sein, da die Plasmid-DNA-Stränge nicht zur Wiederherstellung des neutralen pH-Werts zurückkehren.
Während der Lyse werden Proteine, bakterielle Zellwände und gebrochene chromosomale DNA-Komplexe durch Natriumdodecylsulfat (SDS) umgeben. Diese Komplexe können effizient ausgefällt werden, wenn die Lösung von Natrium-Ionen auf Kalium-Ionen (Ish-Horowicz und Burke, 1981) umgestellt wird. Dann wird das denaturierte Material durch Zentrifugation entfernt, und die zirkuläre Plasmid-DNA kann aus dem Überstand zurückgewonnen werden, wobei die weitere Verwendung der Plasmid-DNA abhängt. Die alkalische Lyse in Gegenwart von SDS ist eine flexible Technik, die mit allen Sorten von E. coli funktioniert und es ermöglicht, mit Volumina im Bereich von 1-500 ml zu arbeiten.