PCR: Grundlagen, Anwendung und Impfstoffherstellung

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine Methode zur kontinuierlichen Replikation eines DNA-Fragments, das ein Gen oder Gene von Interesse enthält. Auf diese Weise erhält man eine große Anzahl von Kopien, wodurch die Probe studiert werden kann, ohne sich Gedanken über die Menge machen zu müssen.

Anfangs war es eine umständliche Technik, da für die verschiedenen Temperaturen, die während des Prozesses verwendet wurden (einige davon sehr hoch), die hitzelabile Polymerase nach jeder Temperaturänderung ersetzt werden musste. Dieses Problem wurde durch die DNA-Polymerase des thermophilen Bakteriums Thermus aquaticus (Taq-Polymerase) gelöst.

Die Methode ist bestechend einfach und beinhaltet die Replikation eines DNA-Strangs von Interesse in einem Medium, das reich an Nukleotidtriphosphaten ist. Diesem werden kleine RNA-Stücke und Taq-Polymerase hinzugefügt.

Durch zyklische Temperaturerhöhungen (die beiden DNA-Stränge werden voneinander getrennt) und -senkungen (die Primer setzen sich fest und die Polymerase kann Nukleotidtriphosphate hinzufügen) verdoppelt sich die Anzahl der DNA-Kopien in jedem Zyklus, was zu einer Million Kopien in 20 Zyklen führt.

Das Reaktionsgemisch wird in ein Gerät (Thermocycler) gegeben, das die Temperatur und die gewünschte Anzahl von Zyklen regelt (abhängig von der Gesamtmenge an DNA, die benötigt wird, wie abgebildet) und die Dauer jedes Zyklus (direkt abhängig von der Länge des zu ergänzenden DNA-Strangs).

Diese Technik hat sich in der Gentechnik als unverzichtbar erwiesen, da sie das Arbeiten mit vernachlässigbaren Mengen an DNA ermöglicht, mit Anwendungen in der Genklonierung, evolutionären Studien (fossile DNA), Kriminalpolizei, Vaterschaftstests usw.

Es können auch hochvariable Nukleotidsequenzen im Genom verstärkt werden, die eine solche Vielfalt von Kombinationen aufweisen, dass zwei davon verbindlich sind, um einen "genetischen Fingerabdruck" zu erstellen, der eine Person oder eine Bande der Verwandtschaft zwischen Einrichtungen genau identifizieren kann. Dies macht sie besonders interessant in der Medizin, Polizei oder forensischen Medizin.

Die meisten Enzyme werden bei Temperaturen über 40 °C denaturiert.

Nukleotidtriphosphate sind der Rohstoff für die Synthese von DNA.

Es ist wichtig zu beachten, dass die Polymerase nur dann aktiv werden kann, wenn sie das erste Nukleotid an eine zuvor gebildete RNA-Kette (Primer) anfügen kann.

Impfstoffherstellung

Die traditionellen Methoden der Herstellung von Impfstoffen lassen sich wie folgt zusammenfassen:

• Verringerung der Virulenz des Organismus, in der Regel mit Formaldehyd.
• Abtötung von Mikroorganismen, meist durch Hitze.
• Inaktivierung der von Mikroorganismen produzierten Toxine unter Beibehaltung ihrer Immunogenität: Toxoide.

Gewinnung von Seren

Gewinnung von Antikörpern aus Tieren, die mit dem Organismus geimpft wurden.

Herstellung von Antibiotika

Dies lässt sich wie folgt zusammenfassen:

Die Kultivierung von Pilzen unter optimalen Bedingungen (Penicillium chrysogenum im Fall von Penicillin).

Reinigung des Antibiotikums, in der Regel durch physikalische Verfahren wie Zentrifugation oder Filtration.

Kristallisation der Verbindung.