Grundlagen der konfokalen Mikroskopie und 3D-Analyse

Grundlagen der konfokalen Mikroskopie

Die konfokale Mikroskopie ermöglicht die dreidimensionale Untersuchung dicker Proben durch die Erzeugung optischer Schnitte (Optical Sectioning), ohne die Probe physisch schneiden zu müssen. Als Lichtquelle wird Laserleistung verwendet, da diese eine bessere Penetration der Proben gewährleistet.

Was ist konfokale Mikroskopie?

• Optische Schnitte: Es werden keine physischen Schnitte der Probe benötigt.
• 3D-Aufbau: Die Rekonstruktion hängt von der Lochblende (Pinhole) ab. Diese Blende lässt nur das Licht aus der fokussierten Ebene passieren und blockiert Streulicht aus anderen Ebenen.

Vorteile gegenüber der Epifluoreszenz

Die konfokale Mikroskopie erkennt ausschließlich die Fluoreszenz der Fokusebene. Dies führt zu einer höheren Auflösung und einem besseren Kontrast, da Fluoreszenzsignale außerhalb des Fokus blockiert werden.

Im Gegensatz dazu erkennt die Epifluoreszenz-Mikroskopie die gesamte Fluoreszenz der Probe ohne Diskriminierung. Das Ergebnis ist ein Bild mit niedrigerer Auflösung und starken Störungen durch Signale aus Ebenen oberhalb oder unterhalb des Fokus.

Funktionsweise und Komponenten

Ein konfokales Mikroskop besteht aus folgenden Komponenten:

• Hochintensive Lichtquelle: Punktlichtquelle (Laser) für das Punkt-zu-Punkt-Scanning.
• Wellenlängen: Typische Systeme nutzen Laser mit Wellenlängen wie 488 nm, 543 nm und 633 nm.
• Detektion: Die Bilder werden auf einem Computer generiert, da sie für das menschliche Auge nicht direkt sichtbar sind.

Signalverstärkung und Detektoren

Laser fungieren als Punktquelle, wobei oft Laser-Combiner mit 3 bis 4 Lasern eingesetzt werden. Ein hochempfindlicher Photomultiplier (PMT) verstärkt das Signal punktweise. Diese Detektoren sind extrem rauscharm und können das Signal eines einzelnen Photons bis zu 100 Millionen Mal verstärken. Die Bildentstehung erfolgt durch punktweise Anregung; das resultierende Bild wird digital rekonstruiert.

Besondere Merkmale und Vorteile

• Verwendung von Plan-Apochromat-Objektiven.
• Simultane Visualisierung von zwei oder mehr Fluorochromen.
• Untersuchung von Lebendproben (Live Cell Imaging) möglich.
• Präzise Steuerung der Laserintensität mittels AOTF (ein- und ausschaltbar).
• 3D-Rekonstruktion: Die wichtigste Funktion ist das optische Schneiden dicker Proben für räumliche Studien.

Ergebnis: Durch diese Technik wird eine signifikante Verbesserung des Kontrasts und der Bildschärfe (optimiertes Signal-Rausch-Verhältnis) und somit eine höhere Auflösung erreicht.

Nachteile der konfokalen Mikroskopie

• Laser haben eine begrenzte Lebensdauer und bieten nur eine begrenzte Anzahl an Laserlinien.
• Nicht alle Fluorochrome können mit Standard-Lasersystemen angeregt werden.
• Einschränkungen bei der zeitlichen Auflösung schneller Prozesse (im Millisekundenbereich) durch das Punkt-Scanning.
• Photobleaching ist weiterhin vorhanden, wenn auch oft reduziert.
• Das System ist im Vergleich relativ teuer.