Mikrobiologische Methoden und Analyse im Wasser

Alternative Methoden und Bakteriologie

Alternative Methoden der direkten Bestimmung der Bakterienbiomasse beinhalten die Analyse von Tiefenbiomasse, Bakterien und die Gewinnung von Nitrit sowie die Bildanalyse zur Untersuchung der C-Ökologie.

Genetische Marker und Techniken

Das GFP (Green Fluorescent Protein) wird durch genetische Rekombination in das Genom eingeführt, um Studien zur Kompetenz in natürlichen Medien zu ermöglichen. Dabei ist zu beachten, dass aerobe Bakterien organische Stoffe und Sauerstoff benötigen. In bestimmten Schichten kann ein Mangel an Sauerstoff oder geeigneten organischen Verbindungen herrschen, was zusammen mit Licht die Cyanobakterien begrenzt.

Gram-positive Bakterien

Gram-positive Bakterien mit niedrigem G+C-Gehalt sowie Ultramikrobakterien der Gattung Sphingomonas können Filter von 0,2 Mikrometern passieren. In einigen Zonen repräsentieren sie den Hauptanteil mit Werten von $10^{12}$ bis $10^{13}$ Zellen/ml, insbesondere in polaren Regionen wie dem Pazifik. Sie zeichnen sich durch Oligotrophie und Unabhängigkeit von Nährstoffschwankungen aus.

Physikalische und Physiologische Trennung

Unter Verwendung physiologischer Charakteristika (wie der Temperatur) werden gekühlte Inkubatoren und Kühlschränke eingesetzt. Dies ermöglicht die physikalische Trennung einer bestimmten Bakterienart aus einer gemischten Kultur.

Bestimmung von Coliformen und Verdünnungsreihen

Zur Bestimmung der wahrscheinlichen Anzahl (Most Probable Number, MPN) von Coliformen in Wasserproben werden Röhrchen-Verdünnungsreihen verwendet, wobei Verdünnungen größer als $1/10^3$ anzeigen, dass die wahrscheinliche Zellanzahl $10^3$ oder mehr Zellen beträgt.

Mikrokosmen und Anreicherung

Ein Mikrokosmos der Anreicherung mittels vertikalem Gradienten zeigt folgende Eigenschaften:

• Von oben nach unten ist der Sauerstoffgehalt abnehmend.
• Die Konzentration von Sulfid nimmt zu.

Es gibt Bakterien, die Nitrit zu Nitrat reduzieren. Bei sulfatreichen Medien, die Acetat oder Ethanol enthalten und unter anaeroben Bedingungen gehalten werden, ist das Stoffwechselprodukt Schwefelwasserstoff ($H_2S$).

Proteolytische Bakterien und der Stickstoffkreislauf

Proteolytische Bakterien sind am Stickstoffkreislauf beteiligt, indem sie Ammoniak aus Proteinen produzieren. Die Anwesenheit oder Abwesenheit wird in Peptonwasser untersucht, inkubiert bei 22 ºC für 24 Stunden. Nach Zugabe von Nessler-Reagenz verfärben sich die positiven Röhrchen orange.

Luminiszente Bakterien und Oberflächenökologie

Luminiszente Bakterien benötigen Sauerstoff und organische Stoffe in der Ursprungsprobe. Der Lebensraum an der Meeresoberfläche ist reich an Polysacchariden und Proteinen.

Methoden zur Zählung

Die Enumeration erfolgt durch:

• Fluoreszenzmikroskopie zur Zählung lebensfähiger Zellen
• Fluoreszenzmarkierte Antikörper
• Konfokalmikroskopie
• Durchflusszytometrie

Ökologische Nischen und Kreisläufe

Ein klassisches Beispiel für die Besetzung hochspezifischer Mikroräume entsprechend den Umwelt- und Vitalbedürfnissen ist die Winogradsky-Säule. Dieses System ist ein vollständiger und autonomer Kreislauf, der nur durch die Lichtzufuhr von außen angetrieben wird. In bestimmten Bereichen wachsen Cyanobakterien, die Sauerstoff produzieren, gefolgt von Purpurbakterien, grünen und roten Schwefelbakterien (anaeroben Sulfatreduzierern), während im unteren Teil schwarze sulfatreduzierende Bakterien zu finden sind.

Kalkulation und Klassifizierung

Es ist möglich, die gesamte bakterielle Form auf einer Oberfläche zu berechnen, indem Volumen und Fläche berücksichtigt werden, um die Zellen pro Milliliter zu erhalten.

Plankton-Klassifizierung

Das System setzt sich aus Picoplankton (0,2–2 µm) und Nanoplankton (2–20 µm) zusammen, insgesamt also 0,2–20 µm.

Wachstumstemperaturen

Die optimale Wachstumstemperatur liegt zwischen 5 und 10 ºC; sie sind in Meeresböden polarer Regionen anzutreffen.

Selektive Nährmedien: TCBS-Agar

Thiosulfat-Citrat-Galle-Saccharose-Agar (TCBS) ist ein selektives und differenzielles Nährmedium für Vibrionen. Gallensalze und ein hoher pH-Wert hemmen die Begleitbiota. Die Toleranz gegenüber Gallensalzen ermöglicht das Wachstum von Vibrionen. Als Kohlenstoffquelle dient Saccharose, kombiniert mit einem pH-Indikator, um Saccharose-positive Vibrionen anhand von Farbumschlägen zu identifizieren.

Extreme Lebensräume und Spezialisierte Bakterien

Zu den spezialisierten Gruppen gehören:

• Barophile Bakterien: Wachsen bei extremem Druck und sind an große Tiefen angepasst.
• Psychrotrophe Bakterien: Haben niedrige optimale Wachstumstemperaturen.
• Oligotrophe Bakterien: Wachsen in nährstoffarmen aquatischen Umgebungen, typisch für marine Bakterien.

Selektivmedien für Streptokokken

Selektive Medien begünstigen das rasche Wachstum der Gruppe der D-Streptokokken und unterdrücken andere Organismen.

Wasserschichtung und Nährstoffkreislauf

Die Trennung von Wassermassen erfolgt aufgrund der Dichte, des Nährstoffgehalts und der photischen Schicht. Die Schichtung (Pyknokline) verhindert die Durchmischung der Wassermassen durch Bewegungen, wodurch Nährstoffe angereichert werden. Dies unterstützt das Recycling organischer Substanzen.

Molekulare und Genetische Techniken

Das grüne fluoreszierende Protein (GFP) wird mittels genetischer Rekombination in das Genom eingeführt. DAPI bindet an die Nukleinsäuren jeder Zelle, während fluoreszenzmarkierte Antikörper spezifisch an Zielantigene binden.

Impkultur und Isolierung

Bei der Ausstrichmethode werden Keime auf dem Nährmedium ineinander übergehenden Linien (Strichen) inokuliert, um am Ende isolierte Kolonien und Reinkulturen zu erhalten. Die Impfung in der Tiefe erfolgt mit einer Impföse oder Nadel vertikal in das Agar.

Molekularbiologische Identifizierung (FISH, PCR und DGGE)

Sonden werden gegen spezifische Gene gerichtet. Die FISH dient dazu, Organismen anhand spezifischer Gene zu identifizieren; dabei wird die Aktivität als Maß für die Viabilität und die Genexpression untersucht.

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) amplifiziert mittels universeller Primer rRNA-Gene aus der Gesamteiweiß- oder DNA-Extraktion. Die erhaltenen Fragmente werden mittels Restriktionsenzymen oder DGGE (Denaturierende Gradienten-Gelelektrophorese) analysiert, kloniert und sequenziert, wodurch phylogenetische Bäume erstellt werden können. Unbekannte Sequenzen können als neue Spezies klassifiziert werden. Die Genexpression kann ebenfalls untersucht werden.

PCR-Ablauf

Notwendige Komponenten sind DNA-Primer, die zu den beiden DNA-Strängen komplementär sind und durch eine Polymerase für die Reaktion erkannt werden. Nach der Hybridisierung der Primer beginnt die Synthese.

Um zu verifizieren, ob die PCR die erwarteten DNA-Fragmente erzeugt hat, können die PCR-Produkte mittels Gel-Elektrophorese auf denaturierenden Gradienten getrennt werden. Diese Fragmente dienen der Sequenzierung und der Erstellung phylogenetischer Bäume.

Nährmedienzusammensetzung und Sterilisation

Komplexe Medien beinhalten Marine-Agar, Eisencitrat, bakteriologisches Pepton und Hefeextrakt (als Energie- und Kohlenstoffquelle für Heterotrophe).

Thermolabile Komponenten

Thermophile oder hitzeempfindliche Medien werden durch Filtration mit Membranfiltern einer Porenweite von 0,2 Mikrometern sterilisiert, da sie durch Hitze leicht denaturiert werden.

Probenvorbereitung und Aufbereitung

Um dispergierte Kolonien zu erhalten, wird eine Ultraschallbehandlung (Sonifikation bei 50 W / 20 kHz / 30 Sek., 3-mal) zur Deflockung durchgeführt. Im Anschluss erfolgt die Behandlung mit Natriumpyrophosphat bei 0,01% W/V.

Diese Techniken ermöglichen eine effiziente Probenahme, insbesondere für das Sammeln von Neuston an der Wasseroberfläche, wobei wenige Millimeter Wasser in die Probe einbezogen werden müssen.