Myoglobin und Hämoglobin: Struktur, Funktion und Kooperativität

1 Myoglobin — Struktur und Funktion

Myoglobin und Hämoglobin sind bekannte globuläre Proteine. Myoglobin gehört zu den am besten untersuchten Kugelproteinen und lässt sich leicht aus roten Blutkörperchen isolieren und reinigen. Es war eines der ersten Proteine, deren Kristallstruktur und Eigenschaften detailliert charakterisiert wurden. Myoglobin diente außerdem als Modell für die Entwicklung von Theorien zur Kooperativität, da später Proteine mit einfacherer Struktur, aber ähnlicher Funktion identifiziert wurden, um das Studium von Hämoglobin einzuführen.

Myoglobin bindet Sauerstoff, der vom Hämoglobin an die Muskeln und andere Gewebe abgegeben wird. Es besteht aus einer einzigen Polypeptidkette, die acht α-Helices trägt, bezeichnet als Helices A bis H (vom N-Terminus aus). An einigen Stellen, insbesondere am Carboxyterminus von vier der acht Helices, kommt die 3₁₀-Helix vor (drei Reste pro Umdrehung). Diese Helices sind dünner und haben eine andere Windung als die α-Helices; sie treten seltener auf und meist in kurzen Regionen, oft am Ende einer Helix oder nahe verzerrten Bereichen. Die Helixsegmente in Myoglobin werden mit zwei Buchstaben bezeichnet, die die benachbarten Schraubenabschnitte bezeichnen (z. B. AB).

Im Myoglobin existiert eine Nicht-Protein-Komponente, das Häm, in einer hydrophoben Tasche, die vorwiegend durch van-der-Waals-Wechselwirkungen gebildet wird. Die Häm-Gruppe enthält ein Eisenatom in der Mitte eines Rings (Porphyrin), das vier Stickstoffatome der Tetrapyrrolringe koordiniert. Die fünfte Koordinationsstelle des Fe ist mit einem Seitenkettenrest verbunden (proximaler Histidinrest, His F8), während die sechste Koordinationsstelle durch ein Sauerstoffmolekül belegt wird; dies ist die primäre Speicherfunktion von Myoglobin. (Eine Koordinationsbindung kann als eine dative Bindung beschrieben werden, bei der ein Atom ein freies Elektronenpaar zur gemeinsamen Nutzung zur Verfügung stellt.)

Auf der gegenüberliegenden Seite des proximalen His (bezogen auf die Ebene des Häm) befindet sich der distale His (His E7). Seine Aufgabe ist es, durch sterische Hinderung und Orientierung die richtige Bindung des O₂-Moleküls an das Fe-Atom zu fördern und so die einfache Oxidation von Fe²⁺ zu Fe³⁺ zu verhindern. Der distale His beeinflusst auch die Bindungsaffinität zu CO und CO₂, weshalb isoliertes Häm eine stärkere Affinität zu CO hat als zu O₂. Zusätzlich wirkt der distale His als Protonenfänger (pK_a des Imidazolrings liegt bei etwa 6) und beeinflusst dadurch die katalytische Wirkung von Protonen auf die Autoxidation von Fe²⁺ (Übergang Fe²⁺ → Fe³⁺ mit gleichzeitiger Bildung von Superoxid O₂⁻).

Die Protonierung des distalen His schützt die Hämtasche im Desoxy-Myoglobin vor übermäßiger Oxidation. Die Bindung eines Sauerstoffmoleküls an das Häm führt zu einer kleinen Konformationsänderung: Das Eisenatom Fe²⁺ verkleinert seinen Van-der-Waals-Radius. Im desoxy-Zustand ist Fe²⁺ hochspin (S = 2, paramagnetisch) und hat einen größeren effektiven Radius; beim Oxy-Zustand ist Fe²⁺ niedrigspin (S = 0, diamagnetisch), wodurch sich der Abstand zwischen Fe und dem Porphyrin verringert. Dadurch nähert sich das Fe-Atom der Häm-Ebene an, zieht den proximalen His mit und überträgt die Bewegung auf die Polypeptidkette. Diese Bewegung wird über die F-Helix (mit dem proximalen His) auf die E-Helix weitergegeben und beeinflusst so den Zugang von O₂. Die Sättigungskurve von Myoglobin für Sauerstoff ist hyperbolisch (Verhältnis MbO₂/Mb als Funktion des pO₂).

2 Hämoglobin — Struktur, Allosterie und Transport

Hämoglobin ist im Gegensatz zu Myoglobin ein Tetramer, bestehend aus zwei Paaren unterschiedlicher Untereinheiten (α₂β₂), die symmetrisch angeordnet sind. Die tertiären Strukturen der Untereinheiten ähneln sehr denen von Myoglobin, obwohl die Sequenzidentität nur etwa 18 % beträgt (evolutionäre Divergenz mit konservativen Änderungen).

Die Untereinheiten sind so miteinander verknüpft, dass ausgedehnte Interaktionen zwischen ihnen bestehen: An der α1β1-Schnittstelle sind z. B. etwa 35 Aminosäurereste beteiligt (und entsprechend an α2β2), während an der α1β2- bzw. α2β1-Schnittstelle nur etwa 19 Reste beteiligt sind. Diese Interaktionen sind hydrophobe Kontakte, Wasserstoffbrücken und Ionenpaare (Salzbrücken), die für die Stabilität und Funktion wichtig sind.

Die Sauerstoffbindung führt zu Veränderungen in der Quartärstruktur, speziell an den Schnittstellen α1β2 und α2β1, nicht jedoch an α1β1 oder α2β2. Dabei variiert der Winkel zwischen den Paaren um etwa 15°, wenn das Hämoglobin vom T-Zustand (tense, geringe Sauerstoffaffinität) in den R-Zustand (relaxed, hohe Sauerstoffaffinität) übergeht. Der T-Zustand wird durch Salzbrücken (Ionenbindungen) stabilisiert. Der Übergang von T zu R wird durch die Energie der Fe–O₂-Bindungsbildung angetrieben, wobei diese Salzbrücken aufgebrochen werden.

Die Bindung des ersten Sauerstoffmoleküls wirkt positiv kooperativ auf die Bindung der folgenden drei Moleküle, wodurch die Gesamtaffinität ansteigt. Das Vorhandensein der beiden Zustände T und R erklärt die sigmoide Form der O₂-Sättigungskurve des Hämoglobins als Funktion des pO₂: zunächst niedrige Affinität (T), später hohe Affinität (R).

Hämoglobin zeigt den Bohr-Effekt: Protonen (H⁺) und CO₂ fördern die Freisetzung von O₂, indem sie die Affinität des Hämoglobins für Sauerstoff verringern. In den Kapillaren produzieren Gewebe CO₂, welches in Erythrozyten durch die Carboanhydrase in Bikarbonat umgewandelt wird (CO₂ + H₂O ⇌ HCO₃⁻ + H⁺); die freigesetzten Protonen werden teilweise von Hämoglobin aufgenommen, was dessen O₂-Affinität senkt und so die O₂-Freisetzung in Geweben fördert. Die Protonierung bestimmter Aminosäurereste kann zur Bildung von Salzbrücken führen, die den T-Zustand stabilisieren (z. B. Protonierung des N-Terminus einer Untereinheit und eines C-terminalen Restes, die dann ionisch interagieren können).

Hämoglobin transportiert auch CO₂ in die entgegengesetzte Richtung zur Lunge. Ein Teil des CO₂ wird als Carbamat an den Amino-Termini des Hämoglobins gebunden; diese Carbamatbildung begünstigt die Freisetzung von O₂ (Gegenseitigkeit der Bindung). Von dem im Blut transportierten CO₂ entfallen etwa 78 % auf Bikarbonat, ca. 9 % sind physikalisch im Plasma gelöst und etwa 13 % sind an Hämoglobin (als Carbamat) gebunden. Obwohl dieser direkte Anteil am CO₂-Transport relativ klein erscheint, spielt die Bindung an Hämoglobin eine wichtige Rolle bei jedem Kreislaufumgang und beeinflusst den Gasaustausch deutlich.

Es gibt zwei Hauptmodelle zur Erklärung des sigmoidalen Bindungsverhaltens des Hämoglobins: das konzertierte (symmetrische) Modell von Monod–Wyman–Changeux (MWC) und das sequentielle Modell von Koshland–Némethy–Filmer (KNF). Im konzertierten Modell existiert das Protein nur in zwei konformen Zuständen (T und R) und alle Untereinheiten wechseln gleichzeitig zwischen diesen Zuständen; dieses Modell erklärt die positive Kooperativität, kann jedoch Fälle negativer Kooperativität nicht gut beschreiben. Im sequentiellen Modell führt die Ligandenbindung an eine Untereinheit zu einer Konformationsänderung, die die Bindungsaffinität benachbarter Untereinheiten beeinflusst; dadurch sind sowohl positive als auch negative Kooperativität möglich (eine Dominoeffekt-Änderung der Untereinheiten).

Die allosterischen Eigenschaften des Hämoglobins zeigen sich deutlich in vitro (im Reagenzglas) versus in vivo (im Blut), weil im Blut zahlreiche Modulatoren vorhanden sind. Ein wichtiger allosterischer Effektor ist 2,3-Bisphosphoglycerat (2,3-BPG), das in Erythrozyten in einer Konzentration von ca. 4,7 mM vorkommt (ähnlich wie die Konzentration von Hämoglobin). 2,3-BPG trägt fünf negative Ladungen bei physiologischem pH und interagiert mit Lysin- und Histidinresten sowie mit den N-terminalen Gruppen der Ketten, wodurch die T-Konformation stabilisiert wird. Die Sauerstoffbindung zieht die Untereinheiten zusammen und verändert die Bindungsstelle für 2,3-BPG, sodass dessen Affinität abnimmt.

Das fetale Hämoglobin besitzt γ-Ketten anstelle der β-Ketten und hat daher weniger positiv geladene Gruppen in der 2,3-BPG-Bindungsstelle; dadurch ist die Bindung von 2,3-BPG schwächer und die O₂-Affinität des fetalen Hämoglobins höher als die der mütterlichen Form, was den O₂-Transport von Mutter zu Fötus begünstigt. 2,3-BPG spielt auch eine Rolle bei der Adaptation an große Höhen: bei Hypoxie erhöht sich die 2,3-BPG-Konzentration in Erythrozyten, wodurch die Affinität des Hämoglobins für O₂ reduziert und die Sauerstoffabgabe in die Gewebe verbessert wird. Langfristig erhöht sich zudem die Anzahl der Erythrozyten (polyzythämische Anpassung).

Ähnliche Anpassungen treten bei Krankheiten mit Hypoxie auf (z. B. pulmonale Insuffizienz oder Anämie), wobei die Mechanismen je nach Ursache variieren (bei Anämie liegt das Problem häufig in der reduzierten Hämoglobinmenge, nicht in der Sauerstoffverfügbarkeit).

Die fraktionelle Sättigung des Hämoglobins für O₂ zeigt ein sigmoides Profil in Abhängigkeit vom pO₂. In einfacher Näherung kann man für kooperative Systeme die Hill-Gleichung verwenden: Y = (pO₂)ⁿ / ((pO₂)ⁿ + (P50)ⁿ), wobei P50 der pO₂ ist, bei dem die Hälfte der Hämoglobinmoleküle gesättigt ist, und n der Hill-Koeffizient (Maß für die Kooperativität). Für Myoglobin (nicht kooperativ) gilt n = 1 und die Sättigungskurve ist hyperbolisch: Y = pO₂ / (P50 + pO₂). Für Hämoglobin ist der experimentelle Hill-Koeffizient etwa n ≈ 2,8 (typischerweise zwischen 2,8 und 3,0), deutlich kleiner als der theoretische Maximalwert 4.

Die Hill-Darstellung log(Y/(1−Y)) gegen log(pO₂) ergibt eine Gerade, deren Steigung die Kooperativität anzeigt (Steigung = 1 bedeutet keine Kooperativität). Graphisch liefert die Hill-Analyse Hinweise auf die Affinitätsveränderungen beim sukzessiven Binden von O₂-Molekülen.

Bestimmte Aminosäuren sind für die Funktion und die adaptive Bedeutung von Mutationen von zentraler Bedeutung, wie im Falle der Sichelzellanämie: Eine Punktmutation in der β-Kette (Glu → Val an einer spezifischen Position) erzeugt das Hämoglobin S (HbS). Diese Mutation führt zur Bildung hydrophober Flächen, die Aggregation von Hämoglobinmolekülen bewirken und die Form und Stabilität der Erythrozyten verändern. Heterozygote Träger (Sichelzelltrait) haben meist weniger Probleme mit Sauerstofftransport, aber sie sind gegenüber Malaria (Plasmodium falciparum) teilweise geschützt, weshalb diese Mutation in bestimmten Regionen, z. B. in äquatorialem Afrika, häufiger vorkommt.

Es gibt viele Mutationen im Hämoglobin-Gen, die zu Erkrankungen führen; allgemeine Gruppen werden als Thalassämien bezeichnet, bei denen die Globinsynthese gestört ist. Etwa 5 % der Weltbevölkerung sind Träger einiger dieser Mutationen. In vielen Fällen führt die Instabilität modifizierten Hämoglobins zu Anämie, weil veränderte rote Zellen nicht korrekt gebildet oder vorzeitig abgebaut werden.